三相分離法是一種提取和部分純 化桔皮 POD 的理想方法；Gagaoua 等采用三相分 離法從無花果樹中純化蛋白酶，三相分 離法是一種簡單、經(jīng)濟、快捷的純化蛋白酶的方法。 但目前尚鮮見關(guān)于利用三相法分離純化滁菊 PPO 。采用三相分離法純化 滁菊 PPO，并對其酶學(xué)特性進行分析，以期為滁菊 采后褐變的控制提供一些理論支持。L3S 型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀 器有限公司；BSA124S-CW 型電子天平，賽多利斯 科學(xué)儀器（北京）有限公司；超聲波清洗器，寧波 海曙科生超聲設(shè)備有限公司；HHS-21-4 型恒溫水浴鍋， 上海博迅實業(yè)有限公司；TGL-16M 型高速臺式冷凍 離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司； PHS-3C 型 pH 計，上海越平科學(xué)儀器有限公司。

    在加入叔丁醇后，體系會形成三相，但中間沉 淀層富含蛋白容易發(fā)生乳化現(xiàn)象。現(xiàn)考察三相分離 的靜置時間對滁菊 PPO 純化效果的影響，三相分離過程中靜置時間對滁菊 PPO 回 收率和純化倍數(shù)沒有促進作用，經(jīng)靜置 5 ~ 80 min 后離心，中間相均可形成一層薄薄的蛋白沉淀層， 經(jīng)回收后測定其酶活回收率在 79.2% ~ 87.7%之間， 純化倍數(shù)在 3.1 ~ 4.2 倍之間。由此可見，在三相分 離純化蛋白質(zhì)過程中，在加入叔丁醇混勻后即開始 離心分離，可以縮短三相分離的時間。以鄰苯二酚為底物， 其反應(yīng)的最適pH值為6.50，最適反應(yīng)溫度為30 ℃， 底物最適濃度為 0.35 mol·L-1，底物 Km和 Vmax 分別 為 0.174 9 mol·L-1 和 961.538 5 U·min-1。滁菊 PPO 對 pH 值和溫度的變化都比較敏感，在 pH 值為 9 的條件下殘存酶活僅剩 24%；70 ℃加熱 3 min，殘 存酶活僅剩 25%，加熱 10 min 殘存酶活僅剩 7.29%。